步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴(kuò)增緩沖液

5X DD-PCR 反轉(zhuǎn)錄緩沖液（250 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3），375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）

DTT ( 100 mmol/L)

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/ml）

5X 測(cè)序膠上樣緩沖液

2. 酶與緩沖液

反轉(zhuǎn)錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶)

用于 DD-PCR 中的反轉(zhuǎn)錄酶是一種 RNaseH 活性缺陷型的酶（如購(gòu)自 Life Tech-nologies 公司的產(chǎn)品 Superscript 或者購(gòu)自 Stratagene 公司的產(chǎn)品 StrataScript）。

熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶

3. 核酸與寡核苷酸

錨定 3'-寡核苷酸引物（300 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 中，內(nèi)含有 0.1 mmol/L EDTA

隨機(jī) 5'-寡核苷酸引物（50 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6）中，內(nèi)含有 0.1 mmol/L EDTA

總 RNA（100 μg/ml）

4. 凝膠

瓊脂糖凝膠

電解質(zhì)梯度測(cè)序膠

5. 放射性物質(zhì)

帶放射標(biāo)記的 dATP（10 μCi/μl，放射性比活度為 3000 Ci/mmol）

6. 專用設(shè)備

自動(dòng)微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴(kuò)增反應(yīng)專用離心管）

正向排液式移液器

PCR 儀

水浴箱水溫預(yù)設(shè)在 65℃ 和 94℃



二、方法

優(yōu)化 DNA 濃度：cDNA 第一鏈的制備

1. 用幾支 0.5 ml 離心管，設(shè)立實(shí)驗(yàn)反應(yīng)管系列，建立對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管的 RNA 最佳濃度，所謂最佳濃度指后續(xù) DD-PCR 擴(kuò)增在凝膠電泳和放射自顯影上呈現(xiàn) 100~300 條譜帶。用水對(duì) RNA 樣品進(jìn)行 5 倍連續(xù)稀釋系列，產(chǎn)生 RNA 樣品濃度范圍在 1 μg/ml 與 100 μg/ml 之間系列。

2. 從錨定 3'-寡核苷酸引物庫(kù)中選擇一個(gè)或更多的引物，設(shè)立不同的稀釋 RNA 模板量的復(fù)性反應(yīng)系列：

RNA 模板                  8.0 μl

錨定 3'-寡核苷酸引物  2.0 μl 

反應(yīng)管在 65℃ 水浴上溫育 10 min，然后放置在 37℃ 水浴上。

復(fù)性反應(yīng)中總 RNA 量應(yīng)該在 8 ng 至 800 ng 之間變動(dòng)。

3. 加入如下復(fù)性反應(yīng)試劑：

5X DD-PCR 反轉(zhuǎn)錄緩沖液         4 μl

100 mmol/L DDT                      2 μl

200 μmol/L 4 種 dNTP 混合液    2 μl

約 25 單位/μl RNase 抑制劑      0.25 μl

200 單位/μl 反轉(zhuǎn)錄酶                0.25 μl

H2O 補(bǔ)足至                             20 μl

反應(yīng)管溫育樣品管在 37℃ 反應(yīng) 1 h。

4. 將反應(yīng)管內(nèi)樣品在 94℃ 加熱 10 min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

優(yōu)化 RNA 濃度：雙鏈 cDNA 的擴(kuò)增與制備

5. 用 8 只 0.5 ml 擴(kuò)增管設(shè)立兩個(gè)實(shí)驗(yàn)系列。每只管應(yīng)該包含如下試劑：

10X 擴(kuò)增緩沖液                                                2 μl

錨定 3' 寡核苷酸引物                                        2 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0)              1 μl

[α-33P] dATP 或 [α-35S] dATP ( 3000 Ci/mmol） 1 μl

5 單位/μl 熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶                            1 單位

H2O                                                                9 μl

對(duì)于每支反應(yīng)管加入 2 μl 5' 隨機(jī)引物，輕彈管壁使反應(yīng)液混勻。

6. 從含有測(cè)試 RNA 與對(duì)照管 RNA 的反轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)系列的 8 支試管中各取 3 μl 樣品，蓋上試管，輕輕混勻樣品。

7. 如果 PCR 儀沒(méi)有配置加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加一滴礦物油（約 50 μl）。放置離心管在 PCR 儀上。

8. 擴(kuò)增反應(yīng)有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下：

9. 擴(kuò)增反應(yīng)程序運(yùn)行結(jié)束后，從 PCR 儀取出反應(yīng)管，每只反應(yīng)管各加入 5 μl 5X 測(cè)序膠上樣緩沖液。

10. 應(yīng)用 DNA 序列分析型的電解質(zhì)梯度聚丙烯酰凝膠電泳分離這種放射標(biāo)記擴(kuò)增物電泳在穩(wěn)壓電源作用下進(jìn)行，到二甲苯腈藍(lán)電泳至凝膠長(zhǎng)度的三分之二處結(jié)束。抽干凝膠，將凝膠放置在放射自顯影底片的下部壓片。

11. 檢查對(duì)照與試驗(yàn) RNA 的不同濃度來(lái)源的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的 DNA 條帶譜型。一種理想的差異顯示的條帶譜型最好能清晰地分辨 100~250 條電泳譜帶。DNA 模板的最佳量對(duì)于不同的樣品、不同的引物也是個(gè)不相同的。選擇對(duì)照與試驗(yàn) RNA 的最適濃度，使得在該濃度下引物配對(duì)引導(dǎo)擴(kuò)增得到最大量的 DNA 產(chǎn)物。

用于差異顯示的擴(kuò)增 cDNA 的制備

12. 應(yīng)用所有的引物組合與 RNA 模板最佳量，重新復(fù)性，反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)計(jì)在 PCR 儀上用 96 孔板即微量滴定板設(shè)立所有的反應(yīng)循環(huán)。

13. 應(yīng)用聚丙烯酰胺測(cè)序膠電泳分離擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，如步驟 9 和 10。用每對(duì)引物所獲得的擴(kuò)增反應(yīng)樣品上樣在測(cè)序凝膠上的毗鄰的泳道上，比如應(yīng)用配對(duì)引物 A + B 從一種 RNA 樣品所獲得的擴(kuò)增樣品與同一對(duì)引物 A+B 從另一種 RNA 樣品所獲得的另一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠泳道上相鄰。用這種方法對(duì)于樣品編排序號(hào)后大大簡(jiǎn)化了對(duì)于放射自顯影帶譜的比較研究。

14. 從不同的 RNA 樣品中用每一對(duì)引物所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的帶譜的比較研究。

在鑒定不同的表達(dá)條帶時(shí)，通常重復(fù)試驗(yàn)確定初始發(fā)現(xiàn)的可重復(fù)性是極為重要的方法。盡管這種預(yù)防措施可能不具有可操作性的，但在理想的情況下，兩種 RNA 的不同批次的樣品應(yīng)該被同時(shí)應(yīng)用，便于相互印證。

差異顯示的 cDNA 的回收與重?cái)U(kuò)增

15. 從抽干的聚丙烯酰胺凝膠上回收目的條帶。防止放射自顯影 X 線片在凝膠的上方，對(duì)于放射自顯影 X 線片上的目的條帶的位置用軟鉛筆輕劃標(biāo)記。用干凈的剃須刀刀刃沿鉛筆標(biāo)記將上層的放射自顯影膠片與下層的凝膠一并切割，切下每一條目的條帶，將目的條帶的凝膠條貼放在 Whatman 3 MM 紙上；將每一薄片的抽干凝膠紙片放入一只 0.5 ml 的離心管（內(nèi)有 50 μl 滅菌水）。

16. 用小的針穿刺每一只浸泡過(guò)夜的 0.5 ml 的離心管的底部；把每一只穿刺管放入一只 1.5 ml 離心管中，離心 20s 后將洗脫液轉(zhuǎn)移至另一只更大的離心管中，丟棄擴(kuò)增管中殘余的凝膠條和 Whatman 3 MM 紙條。

17. 用已洗脫液中的 DNA 片段作模板，在擴(kuò)增反應(yīng)管中一次加入如下試劑：

10X 擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液                             2 μl

聚丙烯酰胺凝膠中洗脫的 DNA 樣品       3 μl

5'-隨機(jī)寡核苷酸引物                             2 μl

3'-錨定寡核苷酸引物                             2 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 7.0)  1 μl

5 單位/μl Taq 熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶          2 單位

H2O                                                    9.5 μl

18. 如果 PCR 儀沒(méi)有配置加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油（約 50 μl）。放置離心管在 PCR 以上。

19. 擴(kuò)增反應(yīng)有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度如下表：

20. 抽取每種重?cái)U(kuò)增樣品的 5%~10%，用 1% (m/V) 瓊脂糖凝膠電泳來(lái)估計(jì)出重?cái)U(kuò)增 DNA 片段的含量。

21. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層（步驟 18），反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

22. 將重?cái)U(kuò)增 DNA 片段連入一種帶有 dT 尾的載體（如 Promega 公司出品的 pEGM T 載體），取部分連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌。

23. 從培養(yǎng)平皿上挑取 6 個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，抽提其質(zhì)粒 DNA，應(yīng)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行酶切鑒定，通過(guò)比較插入片段的大小確定重組轉(zhuǎn)化子。

24. 應(yīng)用盡可能多的途徑和方法對(duì)差異表達(dá)的候補(bǔ)的 cDNA/mRNA 分子進(jìn)行確證，這種確證方法包括 Northern 雜交，RNase 保護(hù)或定量 PCR。應(yīng)用 mRNA 原位雜交技術(shù)能夠?qū)?lái)自某種疾病或不同發(fā)育階段的組織和差異表達(dá)的特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行組織定位。

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