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    原位雜交實(shí)驗(yàn)流程

    發(fā)布時(shí)間: 2024-04-23  點(diǎn)擊次數(shù): 514次

    原位雜交組織(或細(xì)胞)化學(xué)簡稱原位雜交,屬于固相分子雜交的范疇,它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針,在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。


    一、合成RNA探針

    1、設(shè)計(jì)探針引物

    RNA探針長度500bp最為合適。一輪引物不添加啟動(dòng)子序列,二輪引物在正向引物的5端加上T7啟動(dòng)子序列,在反向引物的5端加上SP6啟動(dòng)子序列。


    2、探針合成

    用未添加啟動(dòng)子序列的引物克隆出探針序列的DNA模板,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。膠回收,將其連接到T載體上,轉(zhuǎn)化涂板,進(jìn)行質(zhì)粒提取送測。用添加了T7和SP6啟動(dòng)子序列的引物再次給探針序列兩端添加上啟動(dòng)子序列。取一輪以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳驗(yàn)證,若條帶單一明亮,膠回收PCR產(chǎn)物用于后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄。


    3、體外轉(zhuǎn)錄

    利用PCR擴(kuò)增出的帶有啟動(dòng)子序列探針的DNA模板,分別用相應(yīng)的RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,得到單鏈RNA探針。探針包括正義探針和反義探針,用正義探針(T7RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄得到)進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗(yàn)作為陰性對照組,用反義探針(SP6RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄得到)進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組。體外轉(zhuǎn)錄體系如下:

    組分名稱

    體系

    探針模板

    600ng-1μg

    Transcription Buffer (10×)

    2μl

    RNA Polymerase T7

    2μl

    NTP labeling mixture (10×)

    2μl

    RNase Inhibitor (40U/μl)

    1μl

    RNase-free H2O

    補(bǔ)至20μl

    混勻后37,孵育2小時(shí)。

    4.質(zhì)量檢測、中止消化

    轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,取1ul轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,電泳條帶明亮不彌散則進(jìn)行下一步。驗(yàn)證后,每管加入2DNase,37消化15min,去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)終止消化反應(yīng)。


    5.沉降洗滌保存

    每管用DEPC水補(bǔ)至100uL,加入2倍體積的的無水乙醇和1/10體積的的3M乙酸鈉,置于-80℃沉降過夜/-20℃沉降30分鐘。將沉降后的體系放入離心機(jī)中,4℃,12000rpm離心15分鐘,棄除上清。加入100uL70%無水乙醇浸洗,4℃,12000rpm離心15分鐘,棄除上清,在超凈臺(tái)風(fēng)干。將沉淀的RNA探針加入DEPC水溶解,使其濃度為10ng/uL,分裝后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>


    注意事項(xiàng):

    (1)DEPC 即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可滅活各種蛋白質(zhì),是 RNA 酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在各步處理中,所有液體試劑都應(yīng)經(jīng) DEPC 處理。


    (2)含有 Tris緩沖液的溶液中,不能加入 DEPC。


    (3)原位雜交引物用同一個(gè)遺傳背景的個(gè)體克隆全長測序成功,在測序成功的全長序列上設(shè)計(jì)引物,保證特異性。


    二、雜交

    1、準(zhǔn)備工作

    ①圓形細(xì)胞爬片在濃鹽酸中浸泡過夜,經(jīng)超純水沖洗后,浸泡在無水乙醇中;②將圓形細(xì)胞爬片、玻璃培養(yǎng)皿、金屬鑷子180℃高溫烘4h去除RNase;③取出后靜置1h冷卻,培養(yǎng)皿中加入0.1mg/ml多聚賴氨酸處理。④正、反面各避光浸泡15min;⑤ 用鑷子依次夾取玻片,迅速蘸取DEPC水,正面朝上放在錫箔紙折起的褶皺上,37℃放置3h備用。


    2、組織包埋與切片

    原位雜交實(shí)驗(yàn)組織石蠟包埋,將包埋好的蠟塊從-20℃取出,刀片、臺(tái)面、切片機(jī)等用RNase抑制劑噴霧噴灑擦凈,修整好的蠟塊固定于切片機(jī)上,切片厚度設(shè)置為5μm,將蠟帶在43℃ DEPC水中水浴展開,用多聚賴氨酸處理過的圓形玻片撈取蠟帶,置于錫箔紙褶皺上37℃烘干過夜。


    3、脫蠟與復(fù)水

    鑷子夾取圓形玻片依次于下述玻璃培養(yǎng)皿中:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脫蠟→二甲苯:乙醇(1:1) 6min→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度復(fù)水。


    4、預(yù)雜交

    ①鑷子夾取圓形玻片至24孔板中,每孔加入500μl DEPC水洗滌4min;②加500μl PBST(1×PBS+0.1%Tween-20)洗滌10min,洗2次;③加300μl 2μg/ml蛋白酶K,37℃消化12min;④加500μl 0.1M TEA孵育10min;⑤加500μl PBST 10min,洗滌兩次;⑥加500μl 4%的多聚甲醛,避光固定20min;⑦加500μl PBST,10min,洗滌兩次;⑧加300μl HB雜交液,60℃預(yù)雜交4h。

    HB雜交液的配制:

    組分名稱

    體系

    去離子甲酰    

    10ml      

    20×SSC      

    5ml

    BR              

    4ml

    酵母tRNA(5μg/ml)  

    400μl

    DEPC H2O      

    400μl

    0.1%Tween-20      

    200μl

    HB現(xiàn)用現(xiàn)配,本次實(shí)驗(yàn)一次配制3份。

    5、探針變性與雜交

    將200ng探針加入到30μl HB雜交液中,95℃變性5 min,迅速置于冰上冷卻,然后加入到270μl已60℃預(yù)熱的裝有HB雜交液中1.5ml 無酶管中,充分混勻后加入到樣品孔中,60℃雜交17h。

    6、洗脫探針

    洗脫探針?biāo)迷噭┚?7℃/60℃預(yù)熱,并在相應(yīng)環(huán)境中洗脫。

    洗脫探針條件

    洗脫液

    溫度

    洗滌時(shí)間

    洗滌次數(shù)

    2×SSC      

    60℃

    20min

    2

    2×SSC              

    37℃

    10min

    2

    2×SSC      

    60℃

    20min

    1

    1×SSC                  

    60℃

    20min

    1

    0.2×SSC+ 0.1%tween20

    60℃

    20min

    1

    7、封閉、抗體孵育

    ①向樣品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗滌10min,洗滌兩次。②加入300μl Blocking bufferr(1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20)避光封閉1.5h。③按照1:3000比例將Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗體加入到Blocking buffer中,充分混勻后吸取 300μl 加入樣品孔,避光孵育 1h。

    8、洗滌抗體

    向樣品孔加入500μl MaNaT洗滌抗體,避光洗滌5min重復(fù)2遍,再加入500μl MaNaT洗滌抗體,避光洗滌15min重復(fù)4遍。

    9、顯色及終止反應(yīng)

    吸出 MaNaT,加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗滌兩次,每次5min;按1:50的比例將 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中,充分混勻后吸取 400μl 加入樣品孔,避光顯色10min,鏡檢觀察到藍(lán)紫色信號(hào)時(shí),吸出顯色液。

    10、復(fù)染

    吸出 PBST,加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min;吸出固定液,加入 500μl PBST 洗滌兩次,每次 10 min;吸出 PBST,加入 300μl 1%中性紅染液復(fù)染。

    11、封片

    復(fù)染后,用鑷子夾取玻片,依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脫水;在 100%無水乙醇:二甲苯(1:1)中處理浸泡2min;在二甲苯中浸泡5 min;最終以中性樹膠封片。

    12、顯微觀察

    使用 1 至 4 倍放大倍數(shù)觀察組織雜交整體信號(hào)表達(dá)情況,使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍數(shù)觀察局部雜交信號(hào),拍照。

    原位雜交實(shí)驗(yàn)流程

    A, B:斑馬魚中某基因正義RNA探針信號(hào)分布;

    C, D: 斑馬魚中某基因反義RNA探針信號(hào)分布。

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